プラスミド作製

pUB-GWS-GFPまたはpUB-GWS-Hygを使用したRNAi用コンストラクト作製

Maekawa, T., Kusakabe, M., Shimoda, Y., Sato, S., Tabata, S., Murooka, Y., and Hayashi, M. (2008). Polyubiquitin promoter-based binary vectors for overexpression and gene silencing in Lotus japonicus. Molecular Plant-Microbe Interactions 21, 375-382.\
※ベクターはナショナルバイオリソースから入手可能

方法

1. ターゲット領域（数百bp）をPCR増幅し、pENTR/D-TOPOベクター（invitrogen）にクローニングする。（クローニングー＞Gatewayを参照）
2. シーケンスし塩基配列を確認する。
3. pENTR/D-TOPOをHpaIで切断した後、LR反応でターゲット領域をpUB-GWS-GFPまたはpUB-GWS-Hygに組み込む。
4. カナマイシン（pUB-GWS-GFP）またはハイグロマイシン（pUB-GWS-Hyg）を含むLB寒天培地で選択する。
5. gene specific forward primer / WRKY-fプライマーセットを用いてコロニーPCRを行う（約300bp + ターゲット領域の長さ）。
6. プラスミドを精製し、以下のプライマーセットでPCRを行いコンストラクトが正しくできているか確認する。

プライマーセット

WRKY-f / WRKY-r: 271bp\
gene specific forward primer / WRKY-f: 約300bp + ターゲット領域の長さ\
gene specific forward primer / WRKY-r: 約300bp + ターゲット領域の長さ\
pUBi-r / gene specific reverse primer: 約1kbp + ターゲット領域の長さ\
NosT-r / gene specific reverse primer: 約300bp + ターゲット領域の長さ

プライマー配列

WRKY-f GAGAAGCTAGAACCTGCAAA\
WRKY-r TCTGCTAACGTAAGCCTCTC\
pUBi-r CCATTCTGGAAAACCAAGGA\
NosT-r GATCTAGTAACATAGATGACA