レーザーマイクロダイセクション

実験前日に行うこと

乾熱滅菌（RNaseの失活）

・300mlビーカー、スターラー、バイアル瓶（フタはポリプロピレンなので、RNase Zapで処理）、mold

試薬作製

・DEPC処理水（RNaseを失活させた水）\
　(1)蒸留水999mlに対して、DEPC(発がん性物質)を1ml加える。\
　(2)37℃で１時間以上反応させる。\
　(3)オートクレーブで121℃、30minの処理を行う。\
　　※15minで十分らしいが、DEPCを完全に不活性化させるために時間長めで。

固定試薬（サンプルの状態を固定化させる）\
・Farmer's fixative(エタノール：酢酸＝３：１)\
いずれも分子生物学用を使う。乾熱滅菌済みのバイアルビンに5ml入れて、4℃で保存。

脱水試薬（細胞内の水分をEtOHに置換する）\
・エタノールシリーズ EtOH series\
　75%etOH・・・・・・EtOH:32.5ml, RNase-free water:12.5ml\
　85%etOH・・・・・・　　 37.5ml,　　　　　　　　　7.5 ml\
　95%etOH・・・・・・　　 42.5ml,　　　　　　　　　2.5 ml\
　100%etOH ×２・・・モレキュラーシーブスで脱水したEtOH:50ml\
　4℃で保存

包埋剤（サンプルを包埋する）\
・Steedman's wax(ポリエチレングリコール：1-ヘクサデカノール＝９：１)\
　70℃で融解させ、スターラーで撹拌して作製\
　作製後は、38℃で保存\
Poly(ethylene glycol)400 distrearate 500g (01048, Polysciences)

　
包埋は大まかに３つの過程から成り立っている。

化学固定

1.DEPC処理水を入れたシャーレ(乾熱滅菌済)を２つあらかじめ氷上で冷やしておく。一つめは深さ3mmほど、二つめは水たまり程度。\
2.カミソリをZap紙で拭いて、RNase-freeにする\
3.サンプルを解体して、根の砂を落とし、地上部と根とに切り分ける\
4.ピンセットで根を持ち、１つ目のシャーレで洗う\
5.２つめのシャーレで、カミソリ（RNase-free処理済）を使って根を2-4mm間隔でカットする\
6.RNase-free紙(Zapなど)で根の水分を吸い取る\
7.根を固定液（Farmer's fixative）に浸し、混和させる\
8.4℃・14h振とう

脱水

1.固定液を除く\
2.75%,85%,95%,100%,100%EtOH、それぞれ15min・4℃で脱水\
3.EtOHを半分除き、38℃・10minインキュベート\
4.除いたEtOHの分だけSteedman's waxを加える\
5.EtOH：wax＝1：1の状態で38℃・2h振とう

置換・包埋

1.Steedman's wax、38℃、2h×3で振とうしながらインキュベート
　※waxの入れ替えは、wax凝固防止のために、スライドウォーマー(38℃)上で作業する。\
2.ここからは、スライドウォーマー上で作業する（38℃設定）\
3.金属moldにバイアルビンの中身を出す\
4.根は中央によせて、密集させるように並べる\
5.ミクロトーム固定用のカセットをセットする\
6.waxを流し込む。\
7.スライドウォーマー上から避けて、室温で冷やして凝固させる
※凝固させる時は、サンプルの部分と他の部分が一緒じゃなければならない。\
　 ミクロトームの際に、サンプルの部分だけが分離してしまうことがある。\
8.4℃保存なら14日以内、-80℃保存なら1か月以内であれば、RNAの存在が確認されてる。