免疫電顕

化学固定

試薬

• 70%グルタルアルデヒド\
• 10%パラフォルムアルデヒド（当日作成する。）

```
o 粉末試薬を蒸留水に溶かす。
o 加熱し、1 N NaOHを一滴加え溶解させる。
o 冷やす。
```

• 0.2Mカコジル酸バッファー(pH 7.4)　ヒ素含有　取扱い注意\
• 洗浄液

```
o 0.1Mカコジル酸バッファー(pH 7.4) 　ヒ素含有　取扱い注意
```

• 前固定液

```
o 0.1Mカコジル酸バッファー(pH 7.4) 　ヒ素含有　取扱い注意
o 4%パラホルムアルデヒド
o 0.5%グルタルアルデヒド
```

• 後固定液

```
o 1%四酸化オスミウム
o 1.5%フェロシアン化カリ
```

• エタノールシリーズ（50, 70, 80, 90, 95, 100%）

```
o 100%エタノールにはモレキュラーシーブを入れておき、数日間静置。
```

• プロピレンオキサイド\
• Spurr樹脂

```
o ERL 4206 10 g 樹脂はスポイトで量り取る
o DER 736 6 g
o NSA 26 g
ここまでを混ぜてから、次にS-1を加える。
o DMAE (S-1) 0.4 g
```

• LR White樹脂\
• メタ過ヨウ素酸ナトリウム飽和水溶液\
• TIブルー

```
o TIブルー：蒸留水（1：1）
```

• クエン酸鉛

```
o 煮沸した水にとかしシリンジ中に密閉したもの
```

固定

1. 試料を3mm程度にカミソリで細切する。
2. 前固定液（5-10 ml in a vial or 1.5 ml in a 2 ml tube）に試料を加える。（氷中）
3. 2-3分間脱気する。
4. 氷中で2時間静置する。
5. 洗浄液で数時間おきに数回洗浄する（一晩）。（冷蔵庫）
6. 蒸留水で5分間3回洗浄する。（氷中）
7. 氷上にシャーレを置き、そこに根をひろげる（少量の水を加えておく）。
8. カミソリを用いて根を0.5mm程度に細切する。
9. 後固定液の還元オスミウム（1%四酸化オスミウム、1.5%フェロシアン化カリ）を加え、氷中で30分間（もしくはもう少し短く）静置し、その後蒸留水で5分間3回洗浄する。（膜構造を見る場合）
10. 細切後、素早く20%エタノールに加える（2 mlマイクロチューブ使用）。

脱水

1. 20, 50, 70, 80, 90, 95%エタノールで20分づつ脱水する（液交換はスポイトで行う。ここからは回転機を使う。）。（冷蔵庫）
2. 100%エタノールで20分づつ3回脱水する。（冷蔵庫）
3. 100%エタノールで一晩脱水する。（冷凍庫）
4. 冷蔵庫に移す。

樹脂浸透

LR White 1

1. 100%メタノールに30℃で30分間浸漬させる。
2. 無水エタノールで1回洗浄（4℃30分）する。
3. 100%ジメチルホルムアミド（DMFA）で2回洗浄（4℃10分）する。
4. DMFAで希釈したLR White樹脂シリーズ（20, 40, 60, 80%）で各30分間4℃で浸透させる。
5. 100% LR Whiteで2回浸透させる。30分間4℃（このままオーバーナイト）
6. 100% LR Whiteで3回浸透させる。60分間4℃
7. ビームカプセルにLR Whiteを一杯にまで充てんさせる。
8. 根をシャーレにあけ、爪楊枝を使って根を１－２本加える。
9. 根が沈んだことを確認し、爪楊枝を使って根をなるべく中央に移動させる。
10. 空気がなるべく入らないようにしっかりふたをして、-20℃で12時間程度紫外線重合装置で固化させる。もしくは60℃で24時間。

LR White 2

1. 室温に戻す。
2. 20% LR White（エタノール）で30分浸透させる。
3. 40% LR White（エタノール）で30分浸透させる。
4. 60% LR White（エタノール）で30分浸透させる。
5. 80% LR White（エタノール）で30分浸透させる。
6. 100% LR Whiteで2回樹脂を入れ替える（残った液を綿棒でよく拭き取る）。
7. 100% LR Whiteで一晩浸透させる。
8. 100% LR Whiteで3回で3時間浸透させる。
9. 100% LR Whiteの入ったゼラチンカプセルに移す。
10. -20℃で紫外線重合する（12時間程度、事前に重合時間を見積もる必要がある）。または、60℃で24時間重合させる。

Spurr

1. 室温に戻す。
2. プロピレンオキサイドで5分づつ2回置換する。
3. Spurr樹脂：プロピレンオキサイド（1：2）で1時間浸透させる。
4. Spurr樹脂：プロピレンオキサイド（1：1）で1時間浸透させる。
5. Spurr樹脂：プロピレンオキサイド（2：1）で1時間浸透させる。
6. Spurr樹脂：プロピレンオキサイド（3：1）で1時間浸透させる。
7. Spurr樹脂：プロピレンオキサイド（4：1）で1時間浸透させる。
8. Sppur樹脂で1時間以上浸透させる。
9. Sppur樹脂で一晩浸透させる。
10. Sppur樹脂で3回で3時間浸透させる。
11. 70℃で8－12時間重合させる。

トリミング・セクショニング

1. トリミングする。
2. 200 nmのセクションを作成し、シランコートスライドグラスに張り付ける。（光顕）
3. 80 nmのセクションを作成し、フォルムバール膜を張ったNiグリッドにのせる。（電顕）

免疫染色（電顕）

1. イムノセイバーで加熱処理する。（必要に応じて）
2. 10% H2O2/メタノールで10分間エッチングする。（Spurr樹脂の時）
3. メタ過ヨウ素酸ナトリウム飽和水溶液で30-60秒間エッチングする。（LR Whiteの時だが、基本的にエッチングしなくてよい）注１
4. 5% BSA/PBS pH7.3で30分間ブロッキングする。
5. 1/100一次抗体（濃度検討必要）in 5% BSA/PBS pH7.3（またはin Can Get Signal）で2時間反応する。
6. PBS pH7.3+0.05 Triton X-100で洗浄する。
7. PBS pH7.3で洗浄する。
8. 1/20 10 nm金コロイド標識二次抗体in 0.5% BSA/PBS pH7.3（またはin Can Get Signal）で1時間反応する。
9. PBS pH7.3+0.05 Triton X-100で洗浄する。
10. PBS pH7.3で洗浄する。
11. 1%グルタルアルデヒド溶液で30分間固定する。（金コロイド標識抗体の場合）
12. 密閉容器にオスミウム酸溶液の液滴とメッシュを並べておき1時間置く。（金コロイド標識抗体の場合）。毒劇物のためドラフトで。
13. 蒸留水で洗浄する。
14. DAB溶液で染色し（3-30分間）、蒸留水で洗浄する。（HRP標識抗体の場合）
15. 1%オスミウム酸溶液または1%テトラクロロ金酸ナトリウム1で1分間染色する。（HRP標識抗体の場合）
16. 乾燥させる。

注1．還元オスミウムで後固定した場合、エッチングした方がいい場合がある。

1. 0.5 M NaIO4水溶液で30分間処理し、余分な固定剤を除去する。
2. 蒸留水で洗浄後、0.1 N塩酸溶液で10分間処理し、オスミウム酸を還元する。
3. 0.1%(v/v) Triton X-100が入った0.1 Mグリシン-リン酸緩衝液で15分間処理し、残ったアルデヒドを不活化する。
Newman GR, Jasani B, Williams ED 1983: Metal compound intensification of the electron-density of diaminobenzidine. J. Histochem. Cytochem., 31, 1430-1434.

電子染色1

1. Tiブルーで染色する。
2. 蒸留水で３回洗浄する。
3. クエン酸鉛で染色する。
4. 0.1N NaOHで1回、蒸留水で2回洗浄する。
5. 乾燥させる。

電子染色2

1. 2.5%酢酸ガドリニウム（Gd(CH3COO)3） pH 3（酢酸で調製）で20分染色する。
2. 蒸留水で３回洗浄する。
3. クエン酸鉛で10分染色する。
4. 0.1N NaOHで1回、蒸留水で2回洗浄する。
5. 乾燥させる。
電子染色の試薬はなるべくフレッシュでろ過したものを使用する。

免疫染色（光学顕微鏡）

1. イムノセイバーで加熱処理する。（必要に応じて）
2. 10% H2O2/メタノールで10分間エッチングする。（Spurr樹脂の時）
3. 5% BSA/PBS pH7.3で30分間ブロッキングする。
4. 1/100一次抗体（濃度検討必要）in 5% BSA/PBS pH7.3（またはin Can Get Signal）で2時間反応する。
5. PBS pH7.3+0.05 Triton X-100で洗浄する。
6. PBS pH7.3で洗浄する。
7. 1/5000 horseradish peroxidase (HRP)標識二次抗体in 0.5% BSA/PBS pH7.3（またはin Can Get Signal）で1時間反応する。
8. PBS pH7.3+0.05 Triton X-100で洗浄する。
9. PBS pH7.3で洗浄する。
10. 蒸留水で洗浄する。
11. DAB溶液で染色し（3-30分間）、蒸留水で洗浄する。
12. エンハンサーで染色する。
13. 乾燥させる。