植物体中リン含量

試薬 reagents

* 5%硫酸 5% sulfate 2.5 ml 濃硫酸 conc sulfate/ 50 ml（必ず蒸留水に濃硫酸を加えること）
* 過酸化水素水 hydrogen peroxide 30%原液
* 2.5 M硫酸 2.5 M sulfate 7 ml 濃硫酸 conc sulfate/ 50 ml（必ず蒸留水に濃硫酸を加えること）
* モリブデン酸アンモニウム ammonium molybdate 2 g / 50 ml 沸騰水 bioling water

KH2PO4は110℃で一晩乾燥後デシケータに保存 incubate KH2PO4 at 110℃ overnight and reserve it in a desiccator\
メスフラスコとホールピペットを使用 use volumetric flasks and whole pipettes

粉砕 crush

1. 乾燥後デシケータに保存した試料を用いる。use dry materials
2. 試料が極少量の場合（< 1mg）はそのまま分解に用いる。use whole materials if the amount of the materials is less than 1 mg
3. 試料が少量の場合（数mg）は乳鉢で粉砕する。crush the materials using a mortar if the amount of the materials is several mg
4. 試料が数gの場合は粉砕機で粉砕する。（紛体が飛び散るのでドラフトで）cruch the materials using a blender if amount of the materials is several g
5. 二重のビニール袋を用意し、ラベルを書いた紙と試料を入れ輪ゴムで口を閉じる。preserve the powder in double plastic bags and label the sample ID
湿式灰化 wet ashing
6. 1/16に切っておいた薬包紙の風袋を取る（Zeroにする）。measure a tare (1/16-cut powder paper) and set zero
7. 粉砕試料5-10mgを1/16薬包紙に包み、包んだ後に重量（A）を記録する。（静電気に注意する。アルミ箔で静電気除去）take 5-10 mg powderd samples in the paper, wrap them and weight it
8. 耐熱試験管（Pyrex）に入れる。add the wrapped sample in a test tube made of Pyrex
9. 薬包紙のみも2サンプル用意する。prepare two control samples (only powder paper)
10. ヒートブロックを予め200℃に加熱しておく。（ドラフトで）preheat blocks at 200℃ in a fume hoods
11. 5%硫酸を400µl加える。（専用のマイクロピペットを使用）add 400 µl of 5% sulfate in each test tube using a dedicated pipette
12. 過酸化水素水を100µl加える。add 100 µl of conc. hydrogen peroxide in the test tube using the dedicated pipette
13. 200℃で加熱する。add the test tube in the hole of the blocks and keep at 200℃
14. 過酸化水素水を400µl加える。5回以上加える。add 400 µl of conc. hydrogen peroxide in the test tube more than 5 times
15. 2時間以上加熱する。（試験管の位置を時々入れ替える）keep heating over 2 hours and sometimes change the position of test tubes
16. 壁面に付いた過酸化水素水を蒸留水で数回洗い落とす。（過酸化水素水が残っていると測定できない。）wash out hydrogen peroxide attached to the wall of the test tubes with DW several times
17. さらに約30分加熱する。keep heating for 30 min
18. 放冷する。（一晩放冷した方が発色時に黄色になり難い）cool down
19. マイクロチューブの風袋をとる。weigh empty microtubes
20. 蒸留水を500µl加え、よく撹拌する。add 500 µl of DW into each test tube and vortex
21. スポイトで吸い取りラベルしたマイクロチューブに移す。transfer the solution to a microtube using a Pasteur pipette
22. もう一度蒸留水を500µl加え、スポイトを用いて壁面についた溶液を洗い落とす。add 500 µl of DW into each test tube again and vortex
23. スポイトでマイクロチューブに移す。このときの溶液の重量（B）を記録する。transfer the solution to the microtube, and weigh solution including a microtube

発色

1. 発色液を作製する。（約50サンプル分）make reagent (for 50 samples)

```
2.5 M sulfate 6 ml
Ammonoum molybdate solution 1.8 ml
Antimony potassium tartrate solution 0.6 ml
Ascorbate 0.063 g
DW 44.1 ml
```

2. 検量線用のサンプルを調整する。（1.5 mlマイクロチューブを使用）prepare standard solution in 1.5 ml microtubes

```
Final mg/L 0 5 10 15 20 25 30
50 mg PO4/L standard 0 10 20 30 40 50 60 µl
DW 100 90 80 70 60 50 40 µl
```

3. サンプルと発色液を混合する。（1.5 mlマイクロチューブを使用）mix regent mixture and sample solution in 1.5 ml microtubes

```
発色液 reagent mixture 900 µl
試料溶液 sample solution 100 µl
```

植物体中のリン濃度が高い場合（菌根植物など）は２～３のステップを以下のように変更する。If conc. of P in the materials is very high (like mycorrhizal plants), modify the procedure of step 2-3 as below
2\. 検量線用のサンプルを調整する。（1.5 mlマイクロチューブを使用）prepare standard solution in 1.5 ml microtubes

```
Final mg/L 0 20 50 100 150 200
200 mg PO4/L standard 0 2 5 10 15 20 µl
DW 20 18 15 10 5 0 µl
```

3\. サンプルと発色液を混合する。（1.5 mlマイクロチューブを使用）mix regent mixture and sample solution in 1.5 ml microtubes

```
発色液 reagent mixture 980 µl
試料溶液 sample solution 20 µl
```

吸光度測定 measurement of absorbance

1. 分光光度計を立ち上げる。stat-up a spectrophotometer
2. 発色液添加後15分間放置する。incubate for 15 min
3. 710nmの吸光度（C）を測定する。セミマイクロキュベットを使用。measure absorbance (C) at 710 nm using a spectrophotometer. use a semimicro cuvette\
• 発色後サンプルが黄色を呈した場合は過酸化水素水が残留している可能性がある。灰化後のサンプル0.5mlを90℃で加熱し乾固させ、再び蒸留水で容積をあわせ（0.5ml）リン濃度を測定する。
If the sample solution is yellow, it may contain remaining hydrogen peroxide, which prevent the measurement.\
• 吸光度が0.8以上の場合は、サンプルを希釈し再度発色させ測定する。リン栄養がいい試料は大抵0.8以上の値をとるので、あらかじめ1/5や1/10希釈の試料溶液を作成した方がよい。
If absourbance is over 0.8 which means an unreliable measurement, dilute the sample solution.

計算法 culculation

1. Excellで検量線を作成する。吸光度をx軸に、濃度をy軸にとり、直線回帰する。make standard curve using Excell. x: absorbance, y: conc. of phosphate
2. 以下の計算式で植物体中のリン含量を求める。calculate P content as below\
分解産物のリン酸濃度 conc. of phosphate in ashing product（D, mg PO4/ L）：検量線の回帰式のxに吸光度（C）を代入 substitute C for x of the regression formula\
分解産物のリン酸含有量 content of phosphate in ahsing product（E, mg PO4）：（D）に分解産物の容量（B）/ 1000 (L)をかける multiply D by volume of the sample solution (B) and divide it by 1000\
植物体リン酸含有量 content of phosphate in plant（F, mg PO4/ mg）：（E）から薬包紙リン酸含量を引き（A）で割る subtract E by P content in a powder paper and divide it by A\
植物体リン含有率（%）=（F）に30.97 / 94.97をかけ、さらに百分率を算出 P content in plant (%) = F x 30.97 / 94.97x 100\
分子量 molecular weight\
P: 30.97、O: 16.00、PO4: 94.97、KH2PO4: 136.09

参考図書 reference
土壌環境分析法編集委員会編「土壌環境分析法」博友社．東京．（1997）．p. 268-269.