毛状根作製

１日目

1. ミヤコグサ種子を紙やすりで削った後、表面殺菌する
2. 滅菌ろ紙上に種子を並べ発芽させる。（22℃、dark、３日）

３日目

1. 1/2 B5培地（セフォタキシムなし）を調製する。
2. 角型シャーレに流し込み固める。50 ml/plate

４日目

1. 根が0.2-0.5 cm出ている元気な実生を1/2 B5培地の下の方に並べる。
2. シャーレをシールせずに5シャーレずつまとめてテープをし横にした状態で培養する。（22℃、16/8h light/dark, 100 µmol s-1m-2）
3. フリーズストックAgrobacteriumをLB寒天培地（適当な抗生物質）2枚の全面にたっぷりまく。
4. Agrobacteriumを28℃で2日間培養する。

６日目

1. 15mlファルコンチューブに2mlYMB培地を加える。
2. LB寒天培地上のAgrobacteriumを滅菌薬さじ（小型薬さじ部分の側面がまっすぐなもの）を使って回収し、YMB培地に懸濁する。
3. ボルテックスしよく菌を懸濁させる。
4. 0.5mlの菌懸濁液を1mlシリンジに入れ27Gx3/4の針を取り付ける。
5. 滅菌ろ紙上を敷いたガラスシャーレに約5個体の実生を移す。（乾燥しないように数個体ずつ接種する。）
6. 胚軸の根から1-2mm上のところを27Gx3/4の針で垂直に刺す。
7. 菌懸濁液を1滴たらす。
8. 菌液をよく除いてから角型シャーレに戻す。（培地に埋め込まず、乗せる程度）
9. 5枚ずつまとめてアルミホイルに包む。
10. 横にしたまま22℃、16/8h light/darkで２晩培養する。

８日目

1. アルミホイルをはずし、根の部分を遮光（アルミホイルに黒ビニールテープを貼ったもので覆う）する。
2. 22℃、16/8h light/darkで５日間培養する。

１３日目

1. 1/2 B5培地（+ 150 µg/mlセフォタキシム）培地に移す。
2. 約1cmの毛状根が出るまで培養する。\
※乾燥とカビが大敵である。毎日観察し、こまめに培地を交換した方がよい。カビが増えすぎた場合は、滅菌バーミキュライトに移植する。

２週間後

1. 蛍光実体顕微鏡を用いてGFPまたはDsRedの確認を行う。
2. 根をかみそりで切り落とし、形質転換毛状根のみを残す。
3. 砂耕で栽培する。Rhizophagus irregularisを500 spores/plant接種する。
4. 2日に一度1/2 Hoagland (100 µM Pi)を施用する。
5. 3\~4週間後に蛍光を発する根のみをサンプリングする。栽培期間が長くなると樹枝状体形成率が低下する。

1/2 B5培地（セフォタキシムなし）

```
B5 basal salts 0.83 g
Phytagel 3.0 g
1M MES pH 5.8 1.5 mL
DW to 500 mL
オートクレーブする。
70℃以下に冷やしてから、1000x Vitamin stockを250 µL加える。
```

1/2 B5培地（+ 300 µg/mlセフォタキシム）

```
B5 basal salts 0.83 g
Phytagel 3.0 g
1 M MES pH 5.8 1.5 mL
sucrose 5 g
DW to 500 mL
オートクレーブする。
70℃以下に冷やしてから、1000x Vitamin stockを250 uLと30 mg/mLセフォタキシムを5 mL加える。
```

LB寒天培地

```
Tryptone 2 g
Yeast Extract 1 g
NaCl 2 g
Bacto Agar 3 g
DW to 200 mL
pH7.0に調整し、オートクレーブする。
70℃以下に冷やしてから、抗生物質（x1/2）を加える。
```

YMB培地

```
Mannitol 0.2 g
Yeast Extract 0.04 g
MgSO4.7H2O 0.02 g
NaCl 0.01 g
DW to 100 mL
オートクレーブし、1 mLの0.3Mリン酸カリウム緩衝液（pH6.8）を加える。
```

0.3M K2HPO4./KH2PO4 (pH6.8)

```
K2HPO4 2.59 g
KH2PO4 2.05 g
DW to 100 mL
オートクレーブ
```