高圧凍結固定

機器 equipment

高圧凍結装置　Leica HPM100 (for high pressure cryofixation)\
凍結置換装置　Leica EMAFS2 (for freeze substitution) <br><br>

試薬・器具類

• 0.05 M sucrose
• 70%グルタルアルデヒド glutaraldehyde
• 無水アセトン（数日前にモレキュラーシーブを加え脱水したもの） anhydrous acetone
• エタノール ethanol
• 液体窒素 liquid nitrogen
• 氷 ice
• バイアル瓶 vial medium
• ピンセット forcep
• ハサミ scissors
• カミソリ razor
• ペトリ皿 Petri dish
• ピペット pipette
• マイクロチューブ microtube
• 6 mmキャリアディスク carrier disc


操作 procedure

1. 固定液（1%グルタルアルデヒド入り無水アセトン）を作製しバイアル瓶に加える。免疫染色の場合、高濃度のグルタルアルデヒドは抗原性が低下するので、0.25%などに下げる。 prepare fixation solution (1% glutaraldehyde in anhydrous acetone) in vials. If samples are used for immunostaining, the concentration of glutaraldehyde should be reduced to 0.25%.
2. 凍結置換装置を始動させバイアル瓶を-80℃のエタノールで冷やしておく。 turn on the freeze substitution equipment, and incubate the vials in ethanol bath at -80℃
3. 高圧凍結装置に液体窒素とエタノールを加えスタンバイする。 add lipuid nitrogen and ethanol to the high pressure cryofixation equipment
4. 根を氷上のシャーレにとり、手早くカミソリで5 mmに細切する。 put roots into a Petri dish on ice, and cut the roots into 5 mm fragments by razor
5. 根を実体顕微鏡下でキャリアディスクに重ならないように手早く敷き詰める。 put the root fragments on the carrier disc under dissect microscopy
6. 0.05 M sucroseを一滴加え、もう一つのキャリアディスクで挟む。（余分な液はキムワイプで軽く吸い取る） add one drop of 0.05 M sucrose solution, and cover it with another carrier disc
7. キャリアディスクを凍結ホルダーに取り付け、高圧凍結装置にセットし固定する。2000 bar, -196℃。 set the disc on the holder of the equipment, and fix the sample
8. 液体窒素中でキャリアディスクを取り出し、手早く固定液に投入する。バイアル瓶を軽くかき混ぜ、凍結置換装置に戻す。 take the disc from the bottle filled with liquid nitrogen, and put it into fixation solution in the vial, and return the vial to the freeze substitution equipment
9. 凍結置換装置のプログラムを開始する。-80℃ 48時間、-80℃->-20℃ 10時間、-20℃ 1時間、-20℃->4℃ 10時間、4℃ 48時間 start the program of freeze substitution (-80℃ 48 h、-80℃->-20℃ 10 h、-20℃ 1 h、-20℃->4℃ 10 h、4℃ 48 h
10. 樹脂浸透を行う。 for infiltration

免疫染色でオスミウムで固定した試料を用いる場合

1. 凍結置換の際、グルタルアルデヒドを用いずに、アセトンに2%タンニン酸を加えて-80℃で2日間凍結置換する。
2. 置換固定した試料を同じ-80℃の1%オスミウム酸アセトンにピンセットで移動し、1-5分間反応させる。
3. その後-80℃の純アセトンに2回（1分間ずつ）移す。
4. 最終的に純アセトン溶液で-20℃の冷蔵庫中で20分間保存する。（もしくはドライアイスの箱に詰めて持ち帰ってから行う）
5. その後氷中で保存する。

Spurrの場合

1. 室温に戻す。 to room temperature
2. 無水アセトンで2回（15分ずつ）置換後、プロピレンオキシドで置換し樹脂浸透を行う。 wash with anhydrous acetone twice for 15 min each, and infiltrate the samples with propyleneoxide and Spurr's resin.

LR Whiteの場合

1. 無水アセトンで2回洗浄（4℃30分）する。 wash with anhydrous acetone twice for 30 min each at 4℃
2. 100%メタノールに30℃で30分間浸漬させる。infiltrate with 100% methanol for 30 min at 30℃
3. 無水アセトンで1回洗浄（4℃30分）する。 wash with anhydrous acetone for 30 min at 30℃
4. 100%ジメチルホルムアミド（DMFA）で2回洗浄（4℃10分）する。 wash with 100% DMFA twice for 10 min each at 4℃
5. DMFAで希釈したLR White樹脂シリーズ（20, 40, 60, 80%）で各30分間4℃で浸透させる。 infiltrate with diluted LR white resin (20, 40, 60, 80%) by DMFA
6. 100% LR Whiteで2回浸透させる。30分間4℃（このままオーバーナイト） infiltrate with 100% LR White twice for 30 min (or overnight) at 4℃
7. 100% LR Whiteで3回浸透させる。60分間4℃ infiltrate with 100% LR White three times for 60 min at 4℃
8. ビームカプセルにLR Whiteを充てんさせ、根を数本加える。 fill with LR White into beam cupsules, and add several roots there
9. ふたをして、-20℃で12時間程度紫外線重合装置で固化させる。 close the lid, and polymerize the resin by irradiating UV for 12 h at -20℃