lore1スクリーニング

DNA抽出 DNA extraction

1. 植物個体とチューブ類にナンバリングする。numbering of plants.
2. 小葉3枚を2 mlマイクロチューブ（金属クラッシャー専用）に入れる。put 3 folioles to a 2 ml micro tube.
3. マイクロチューブに金属クラッシャーを加える。add a metal crusher to the microtube.
4. あらかじめ冷やしておいたDNA抽出バッファーを0.5 ml加える（冷やすとSDSが析出するのでよく懸濁してから加える）。add 0.5 ml of ice-cold DNA extraction buffer.
5. ビーズクラッシャーµT-12で30秒間（2500 rpm）破砕する。crush the sample for 30 sec (2500 rpm) with BEADS CRUSHER µT-12.
6. ４℃で１分間程度冷却する。cool at ４℃ for about 1 min.
7. ビーズクラッシャーµT-12で30秒間（2500 rpm）破砕する。crush the sample for 30 sec (2500 rpm) with BEADS CRUSHER µT-12.
8. 0.2 mlの破砕液を新しい1.5 mlマイクロチューブに移す。transfer 0.2 ml of crushed sample to a 1.5 ml microtube.
9. 0.5 mlの100%エタノール（DNA用）を加え、転倒混和する。add 0.5 ml of 100 % EtOH and mix.
10. 室温で10分間放置する。incubate for 10 min. at room temperature.
11. 12,000 rpmで15分間、室温で遠心する。centrifuge at 12,000 rpm for 15 min at room temperature.
12. 上清をアスピレーターまたはP1000ピペットで吸い取る。極力エタノールを除く。remove the supernatant using an aspirator or a P1000 pipette.
13. 0.5 mlの70%エタノール（DNA用）を加え、混和し8,9を繰り返す。add 0.5 ml of 70 % EtOH, mix and repeat step of 8 and 9.
14. 100 µlのTEを加える。add 100 µl of TE.
15. MT-360にかけ（1-2分間）DNAをよく溶解する。溶け残りが出るが問題ない。dissolve DNA well using the MT-360 for 1-2 min.
16. -20℃で保存する。Store at -20℃.
17. 金属クラッシャーは洗浄し再利用する。\
DNA抽出バッファー

```
200 mM Tris-HCl pH 8.0
250 mM NaCl
25 mM EDTA
0.5% SDS
（20本分12ml；1 M Tris-HCl pH 8.0 2.4 ml, 5 M NaCl 0.6 ml, 0.5 M EDTA 0.6 ml, SDS 0.06 g）
```

PCR増幅 PCR amplification

1. PCR反応液を用意する。prepare PCR solution.

```
MilliQ water 4 µl
2x Quick Taq HS DyeMix 5 µl
specific primer f (10 µM) 0.2 µl
specific primer r (10 µM) 0.2 µl
P2 primer (10 µM) 0.2 µl
template DNA 0.4 µl
```
2. PCR反応を行う。run PCR.

```
94℃ 2 min
94℃ 10 s ┐
60℃ 30 s │ 35 cycles
68℃ 30 s ┘
4℃ hold
もしくはタッチダウンPCRで行う。以下のサイトを参照。
https://lotus.au.dk/meta/faq
```
3. 電気泳動を行う（2%アガロース）。perform 2 % agarose electrophoresis.

アクリルアミドゲル電気泳動

ゲル板作製

1. ゲル板を組み立てる。
2. 切れ込みの無いゲル板をキムタオルの上に置く。（ゲル面を70%エタノールで拭いてから乾かす）
3. シールチューブを下端に置く。（シールチューブもよく拭いておく。シールチューブの下辺がまっすぐになるように設置する）
4. 切れ込みのあるゲル板を上から重ね合わせる。
5. シールチューブをゲル板のスペーサー両端に沿わせてセットする。
6. ステンレス製クリップで左右下を２か所ずつ留める。（ゲタの上を留めること）
7. ２枚のゲル板の下と横の辺がきっちり揃っていることを確認し立てかけておく。
8. 分離ゲルと濃縮ゲルを作成する。
9. 蒸留水と緩衝液、アクリルアミド溶液を電動ピペッターで50ml遠沈管に加える。
10. よく撹拌した後、10\~15分間脱気する。（50ml遠沈管の蓋を軽く乗せておく）
11. 溶液が室温になっていることを確認する。
12. 10%過硫酸アンモニウム（用事調製）を加えよく撹拌する。
13. TEMEDを加えよく撹拌する。
14. 分離ゲルにTEMEDを加えたら直ちに電動ピペッターを用いてゲル溶液をゲル板の半分程度まで流し込む。この際、ゲル板を横に少し傾け、端から流し込む。
15. ゲル板を左右、前後に傾けゲル溶液を均一にする。
16. さらにゲル溶液を赤ラインより少し上まで流し込み、ゲル板を左右、前後に傾けゲル溶液を均一にする。
17. ゲルが固まるのを待ち、ある程度固まったところ(20\~30分)で、蒸留水を張る。もしくは、ゲル溶液を注いだのちにただちに1-ブタノールを張る。エアコンの風が直接当たらないことを確認する。
18. 約30～60分後に蒸留水または1-ブタノールをキムワイプで吸い取る。1-ブタノールを使用した場合は蒸留水で数回洗浄する。
19. 再度蒸留水を張り、ゲル板を揺すってゲル境界面を洗浄する。洗浄後、蒸留水をキムワイプで全て吸い取る。
20. 濃縮ゲルを作成する。（分離ゲルと同様）
21. 濃縮ゲルにTEMEDを加えたら直ちにゲル板にゲル溶液を流し込む。
22. 直ちにコームをさす。（ゲル板を揺すってゲルをまっすぐにする）
23. ゲル板上部をサランラップで覆い、できるだけ空気を遮断する。
24. ゲルが固まったところで（20～30分）湿らせたキムワイプをコームの上からかぶせる。
25. ゲル板を湿らせたキムタオルとサランラップで包む。
26. ラミネートフィルムでシールし、冷蔵保存する。

泳動準備

1. ゲル板からコームとシールチューブを取る。
2. クリップを外す。
3. ゲル板を泳動槽にセットする。１枚だけ泳動する場合も、もう１組のゲル板を反対にしてセットする。
4. 泳動槽にランニングバッファーを加える。
5. P200ピペットを用いて、1ウェルづつ洗浄する。

電気泳動

1. サンプルにローディングバッファーを1 μl加える。電動8連ピペット使用し、チューブの上の方に滴下する。(Quick Taq使用時は添加する必要は無い。)
2. 遠心し、ローディングバッファーを落とす。
3. 電気泳動用のローディングチップを用いてサンプルを2 µlアプライする。（軽くピペッティングしてからアプライする。）
4. 100 bp ladder DNAマーカーを2 μlアプライする。
5. 上部蓋をし、コードを接続する。
6. 20 mA/枚に設定し電気泳動を開始する。
7. BPBが流れ切ったところで泳動をやめる。
8. 泳動バッファーを廃棄する。
9. ゲル板を取り出し、コテを用いて上部ゲル板（切り込みなし）をはがす。
10. ゲルの側面をコテでなぞる。
11. ゲルの裏表ば分かるように、右下に切り込みを入れる。
12. 複数のゲルを識別するため、上部に切り込みを入れる。
13. 10,000倍希釈したGelRed（TAEで希釈）が入ったタッパーにゲルを入れる。２枚まで。
14. シーソーシェイカーで20～30分間染色する。
15. ゲルを撮影する。

4%分離ゲル（1枚分, 20 ml）

```
10xTBE 2 ml
30% acrylamide:BIS (29:1) 2.6 ml
DW 15 ml
10%過硫酸アンモニウム 333 µl
TEMED 16 µl
```

濃縮ゲル（1枚分）

```
0.5M Tris-HCl pH 6.8 1.6 ml
30% acrylamide:BIS (29:1) 1.0 ml
DW 3.15 ml
10%過硫酸アンモニウム 50 µl
TEMED 6.66 µl
```

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